DNA 혁명 크리스퍼 유전자 가위 2021년 7월 본 (2) : 크리스퍼가 온다
크리스퍼가 온다 - 제니퍼 다우드나, 새뮤얼 스턴버그 (2018)
크리스퍼 1차 논문 발표는 2012년.
2020 노벨 화학상 수상자 에마뉘엘 샤르팡티에(52): 프랑스 출신, 독일 막스플랑크 감염생물학연구소 교수.미국 버클리 캘리포니아대(UC버클리대) 제니퍼 다우도너 교수(56). 책을 읽고 모호했던 크리스퍼의 의미, 구조의 기능을 생물학적으로 확실히 알 수 있었다.삽화가 조금 있지만 이해하기 쉬웠다.(다른 생물학 관련 책들도 이런 삽화를 넣었으면 한다.) 밤부의 연구 진행 내용은 마치 소설처럼 읽었다.비전공자가 읽으면 다소 이해하기 어려운 점도 있을 것이라고 생각했지만 그래도 전체적으로 알기 쉽게 적혀 있다고 느꼈다.이 책에서 자신이 발견한 기술에 큰 자부심을 갖고 있음을 알 수 있었다.크리스퍼 기술에서 파생되는 여러 가지 걱정거리는 물론 알지만 그럼에도 불구하고 기술의 긍정적인 활용에 기대를 거는 눈치다.
읽고 자세히 알아보면 생각보다 더 대단한 기술이다. 심지어 구현하기 쉽고 이론적으로는 그 활용도가 무궁무진하기 때문이다.크리스퍼를 인간의 질병 치료에 어디까지 적용하느냐가 향후 쟁점이 될 것으로 보인다.현재는 인간 배아 실험이 연구 목적에 한해 매우 한정돼 있지만 이것이 풀리는 순간에 판도라 상자가 열리는 것은 아닌지 모르겠다. 올더스 헉슬리의 소설 멋진 신세계는 전혀 근거 없는 공상소설이 아니었다.유전자 치료, 맞춤형 치료 시대가 오는구나
일부 도구
크리스퍼는 세균의 항바이러스 면역 체계이다.
인류세:인류가 지구의 기후와 생태계를 변화시켜 만들어진 새로운 지질시대.
염색체 파열(Chromothripsis)은 최근 발견한 현상으로 염색체가 갑자기 산산조각이 났다가 복구되는데 이때 염색체 안에서 광대한 유전자가 조작된다. 세포가 죽을 수도 있고 암에 걸릴 수도 있다. WHIM증후군(치명적 면역결핍 질병) 환자인 킴씨는 염색체 파열로 질병의 원인인 CXCR4 유전자가 없어지면서 증후군이 사라졌다. 대단한 행운이다. 이 행운의 혈액세포는 조혈모세포였을 것이다.
우성유전병(헌팅턴병)은 바이러스 벡터에 정상 유전자를 하나 더 넣는다는 단순한 유전자 치료로는 효과가 없다. 이 병을 고치기 어렵다면, 유전자를 삽입하지 말고 결함을 고칠 필요가 있다.
상동 재조합은 난자와 정자 생성 때 일어난다(감수 분열 때 교차).세포가 조작 DNA를 게놈에 원래 있던, 조합하지 않으면 안 되는 여분의 염색체라고 착각하게 하면, 과학자는 새로운 DNA를 원래 존재하던 유전자 암호에 상동 재조합을 통해서 결합시킬 수 있다(유전자 편집이라고 부른다, DNA를 인산칼슘과 섞어 세포에 쏟는, 리포좀-비바이러스성 벡터). 겸상적 혈구병 환자의 혈액 줄기세포를 '상동 재조합' 치료법으로,
유전자 편집의 가장 큰 문제점. 게놈에 무작위로 들어가 버리는 비상동조합이 생긴다는 것이다.이 중 나선 파손의 복구 메커니즘은 난자와 정자 형성 과정에서 일어나는 상동 재조합, DNA가 손상됐을 때 일어나는 재결합 등이 있다. 모든 세포는 X선이나 발암물질 같은 DNA 손상물질에 노출돼 손상된 DNA를 효율적으로 복구한다.두 개의 염색체를 갖는 것은 진화상의 유용성을 나타낸다. 한 염색체에 손상을 주더라도 다른 염색체와 일치하는 서열을 찾아 복제하면 복구할 수 있다. DNA가 자연 손상된 것처럼 세포를 속이고 새로운 DNA를 쌍을 이루는 염색체로 위장시켜 제공하며 세포가 파손된 부위를 수정시킨다.
<유전자 편집툴의 발달> 제한효소 →(1세대) ZFN →(2세대) 탈렌 →(3세대) 크리스퍼 유전자 편집에서 중요한 것은 올바른 위치를 절단하는 것이다.핵산 내부의 가수분해효소 I-Sec I는 매우 특이성이 높지만 염기서열 18개가 정확하게 일치해야 DNA를 절단한다(통상 제한효소는 6개를 인식함). 그러나 이처럼 특이성이 높은 제한효소는 거의 없다.
차세대 유전자 편집 툴의 세 가지 조건.우리가 원하는 특정 DNA 서열을 인식해야 한다.2. 바로 그 DNA서열을 잘라야해3. 다른 DNA 서열(다른 유전자 서열)을 표적화해 자르도록 프로그램(수정)하기 쉬워야 한다.
I-SecI는 3을 채우지 못했다
제1세대. ZFN 키메라핵산가수분해효소. 징크핑거누클레이스(ZFNFok I의 DNA 절단 부위+징크핑거 단백질의 DNA 인식 부위) 원하는 DNA 서열을 인식해 잘라낼 수 있다. 하지만 엉뚱한 곳을 자르거나 DNA 서열을 인식해도 잘리지 않는 등 정확성이 떨어지는 단점과 고도의 전문 연구팀이 생기는 데다 설계는 쉽지만 실제 작업이 매우 어렵다는 단점이 있다. 보다 안정적이고 사용하기 쉬운 신기술이 요구되었다.
탈렌(TALEN, TALEs핵산가수분해효소, TALEs를 징크핑거뉴클레이스가 사용한 DNA 절단 부위와 결합시킨 것. 산토모나스의 핵산인식단백질과 FokI제한효소로 합성한 유전자 위. 산토모나스과에 속하는 식물병원성 박테리아의 특정 DNA결합단백질(TALE)로 DNA 염기서열을 인식한다. 그리고 ZFN과 마찬가지로 FokI핵산분해효소를 사용하여 절단한다.) 전사활성화인자 유사조절인자(transcriptionactivator-like effectors, TALEs) TALEs 단백질은 징크핑거 단백질과 구조가 매우 유사하다. 여러 개의 반복된 분절로 구성되며 각 분절은 특정 DNA 염기서열을 인식한다. 그러나 차이점은 퉁퉁한 핑거 단백질 손가락 1개가 DNA 염기서열 3개를 인식하는 반면 TALEs 분절 1개는 1개의 DNA 염기를 인식한다는 것이다.TALEs와 DNA 절단 부위를 결합해 탈렌이 만들어지고 구조와 설계가 개선돼 ZFN보다 쉽게 만들어 사용할 수 있을 것으로 기대됐다.하지만 탈렌은 곧바로 등장한 강력한 3세대 주자 크리스퍼의 등장으로 자리를 내줬다.
3세대. 크리스퍼. -------------------------------------------------------------------
ᅳ퍼퍼. CRISPR. clustered regularly interspasced short plaindromic repeats. 전후가 같은 서열인 짧은 회문구조가 간격을 두고 반복되는 구조의 집합체이다.
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바이러스에 관한 연구 박테리오파지는 세균 바이러스이다.박테리오파지 치료법(환자에게 파지 주입, 파지는 동물세포에는 감염되지 않음)은 항생제가 개발되면서 벌써부터 설 자리를 잃었다. (이런 치료법도 있었구나~) 세균도 많지만 세균 바이러스는 세균의 10배가 넘는다. 세균 바이러스는 수십억 년 동안 효율적으로 세균을 감염시키도록 진화했다.식물 동물 세균도 수십억 년 동안 이들 바이러스로 방어전략을 진화시켰다.
세균의 바이러스 방어법 4가지.자기 DNA의 화학적 형태를 미묘하게 변화시키는 전략. 제한효소로부터 자신의 DNA를 보호하고 외부 DNA를 파괴한다.2. 파지가 만든 구멍을 막는다 3. 파지가 묻지 않도록 한다.4) 자살
새로 밝혀진 다섯 번째 방어법이 바로 크리스퍼다.
크리스퍼 작용을 이해하려면 「캐스 유전자」를 알 필요가 있다.
캐스(cas, 크리스퍼 관련 유전자) 캐스 서열은 크리스퍼 영역에 거의 항상 붙어 있는 유전자군이다. 크리스퍼 DNA가 있으면 반드시 캐스 유전자도 가까운 곳에 존재한다.캐스 유전자는 RAN이나 DNA 분자를 자르는 효소를 암호화하고 있다.
캐스 단백질 복합체(캐스케이드1011종의 다양한 캐스 단백질 복합체)는 크리스퍼 RNA(가이드 RNA)와 일치하는 바이러스 DNA와 짝을 이루면 바이러스 DNA를 절단한다. 캐스케이드가 캐스3를 RNA-바이러스 DNA 결합체로 불러오면 캐스3는 박테리오파지 게놈 염기를 초당 300개씩 읽어내면서 DNA를 완전 분해한다(한 곳의 절단이 아니다). 초분해! 와우~
크리스퍼 분류 두 그룹타입1, 타입2, 타입1, 대장균, 녹농균. '카스3' 효소가 DNA를 분쇄한다.타입2. 스트렙토코커스 서모필러스(유산균). 캐스3와 캐스케이드(캐스단백질복합체)가 없다. 캐스9 있어 캐스9 단백질이 작용하려면 트레이서 RNA가 필수다.
실험, 가이드 RNA와 트레이서 RNA를 접속한다(키메라 RNA).해파리의 GFP 유전자에서 서로 다른 20개의 염기서열을 5부분 골라 표적으로 삼았다.모든 GFP DNA가 의도한 위치에서 절단되어 있음을 확인했다.2012년 6월, 사이언스에 첫 논문 발표.
만약 우리가 염기 20개분의 RNA암호를 특정 인간 유전자 서열과 일치하도록 바꾸고, 이 새로운 가이드RNA와 캐스9을 사람의 세포에 이식하면 크리스퍼는 표적 유전자를 정확히 잘라 세포가 그 위치를 복구하도록 흔적을 남기게 된다. 세포는 이 손상을 인식하면 복구하게 된다. 상동 재조합 방식으로 복구한다. 이것이 크리스퍼를 이용한 DNA 편집의 원리다.
실험. 플라스미드1: 가이드RNA유전자. 플라스미드2: 캐스9유전자+핵위치서열+GFP표적대상유전자: CLTA유전자(클라스린의 L사슬을 암호화하는 유전자, 클라스린은 내포작용시 피복소낭형성 단백질이다)인간신세포(HEK293)로 실험.리포좀(지방분자가 들어간 비누수와 같은 용액) 이용. 많은 세포가 녹색 형광을 발현한다. 많은 가이드 RNA가 생산된 것도 전기영동으로 확인.가이드 RNA 서열과 정확히 일치하는 위치가 편집되어 있음을 유전자 분석에 의해 확인한다.2012년 12월 두 번째 논문 발표.
인간과 모든 진핵생물은 발암물질, 자외선, X선 등으로 인해 생기는 DNA 손상을 복구하는 체계를 진화시켜 왔다. 크리스퍼가 유전자를 자르는 데 성공하면 세포는 금속파이프 두 개를 용접하듯 단순하게 DNA를 다시 붙인 것이 기본 시나리오다. 이 과정을 비상동 말단 부착이라고 한다. 결실 삽입 등의 오류가 많다.
크리스퍼가 소개되면 엄청난 양의 논문과 연구결과가 쏟아져 나온다.
크리스퍼로 유전자 편집을 한 쥐를 만드는 과정.크리스퍼 구성요소를 '단세포배(수정란인가?)'에 미세주입법으로 주입. 착상. 임신. 출산.이후 크리스퍼는 다양한 식물과 동물에 적용된다. 너무 많아. 이제 인간도 예외일 수 없어.
아직 사람에게 직접 크리스퍼를 주입할 수는 없지만 사람 세포에서는 실험(체외세포 수준 실험)이 이뤄졌다.폐세포 – 낭포성 섬유증을 일으키는 유전자 돌연변이를 수정하기 위해 혈액 세포 – 겸상적 혈구병과 베타 지중해성 빈혈을 일으키는 돌연변이를 교정하기 위해 근육 세포 – 듀센근이 영양증의 원인인 돌연변이를 고치기 위해 과학자들은 크리스퍼를 이용하여 줄기세포의 돌연변이를 교정하고 복구하며, 줄기세포는 영양증의 원인인 돌연변이를 고치면 어떤 조직도 변이에도 변이를 교정하고, 줄기세포는 유전 세포는 유전자의 변이를 수정할 수 있다.과학자들은 인간 암세포에서 수천 가지의 유전자를 편집했다(신약의 표적이 되는 유전자와 새로운 치료법을 찾기 위해).
세포의 첫 번째 복구 메커니즘 비상노동조합 오류가 많은 복구동물의 유전학은 크리스퍼를 사용하여 유전자를 녹아웃시키기도 한다. 절단된 유전자가 연결되었을 때 비상동조작(삽입이나 결실(in-dels, 인델) 등 오류가 일어나기 쉬운 복구, 말단부착)이 일어나는 경우이다.TYR유전자(티로시네이즈효소. 멜라닌 생성에 관련된다)를 표적으로 하는 크리스퍼를 쥐의 수정란에 짜넣는다. 알비노 쥐의 출생 녹아웃으로 다양한 실험 동물 모델(질병을 가진다)을 만들 수 있었던 녹아웃은 유전자 편집 전략의 하나일 뿐이다.억제된 유전자로 고생하는 환자에게는 유전자 결실(녹아웃) 방법은 쓸모가 없다. 염기를 편집하고 교정하는 방법이 필요하다.
세포의 두 번째 복구 메커니즘 상동 재조합 정확한 복구상동재조합은 겹겹이 쌓인 파노라마 사진을 이어 붙여 완성하는 것과 비슷한 수복의 주범이 있으면 세포는 보다 나은 수복방법을 택한다.크리스퍼에 의해 절단된 유전자 영역과 일치하는 복구 거푸집을 크리스퍼와 결합해 삽입하면 세포는 기꺼이 받아들여 손상 부위에 복구 거푸집을 붙인다.
크리스퍼로 두곳을 절단(가이드 RNA 2종류를 사용)하였을 때, 세포의 DNA 편집방법. 1.말단부착복구(다시 접속). 2.결실(조각을 버리고 양끝을 붙이고, 영화필름에서 장면을 잘라내듯). 3.역위
크리스퍼의 또 하나의 적용. 절단 능력을 없앤 방법무효화된 크리스퍼 체계 크리스퍼를 유전자 발현 조절자(활성 또는 억제)로 변신. 무효화된 캐스 9는 DNA 서열을 여전히 찾을 수는 있지만 자르지는 못한다. 무효화된 크리스퍼 시스템은 짐을 나르는 말과 같다. 단백질 수화물은 활성자 또는 억제자이다.세포를 다양한 악기로 구성된 오케스트라라고 생각하면 건강하고 정상적으로 기능하는 세포로 다양한 악기 소리는 완벽하게 균형을 이루는 악성 종양 세포나 감염된 세포에서는 소리의 균형이 깨져 특정 악기의 소리가 너무 크거나 약하게 들린다. DNA 편집(여러 악기를 노골적으로 없애거나 대체하는 것)은 조악한 선택이다. 불활성화된 크리스퍼 체계는 오케스트라의 어떤 악기든, 즉 게놈 안의 어떤 유전자든 고감도로 미세 조정할 수 있다.
조잡한 말단 부착이든 정확한 상동 재조합이든 절단 부위가 한 곳이든 여러 곳이든 절단 부위가 없어도 가능성은 무궁무진하다. 크리스퍼의 완벽한 도구를 갖춘 과학자들은 이제 게놈 구성과 그 결과물을 거의 완전히 제어할 수 있게 되었다.리스퍼의 장점.쉽다 싸. 싸다
이부 과업
농업에서의 크리스퍼 활용 예. - Mlo유전자만 편집(돌연변이를 일으켜)하여 보리의 백분병 저항성 획득.
가축 유전자 편집의 예.-장점을 갖춘 새로운 품종 만들기.-염소 배아에 크리스퍼 주입. 배아를 대리모의 자궁에 착상. 더 많은 살과 캐시미어를 생산하는 염소를 만든다.바이러스가 돈세포에 감염하는 경우, CD163을 인식한다. 크리스퍼를 이용해 이 유전자가 삭제된 돼지를 만든 뒤 바이러스 감수성 시험한다. 열쇠를 훔친 도둑을 막기 위해 집 열쇠를 바꾸는 것과 비슷한 전략이다. 유전자를 편집한 돼지는 건강했고 바이러스에 감염되지 않았다.
GMO와 비GMO의 경계와 규제.전형적인 GMO는 외부 유전자가 내장된 것으로 이전에는 생물체에 없던 장점을 부여하는 것으로 새로운 단백질을 합성한다. 이와 달리 유전자 편집을 한 생물은 원래 존재하는 유전자에 작은 변형을 주고 원래 있던 단백질의 생산농도를 조금 다르게 해 생물체에 장점을 준다. 외부 DNA는 삽입되지 않는다.
유전적으로 변형됐다는 정의를 어떻게 내리느냐에 따라 정부기관의 규제와 대중의 인식은 달라진다. 외부 DNA를 삽입하는 것이 아니라 원래 연어 자신의 성장호르몬을 계속 확대하도록 했다면 이 연어는 GMO일까. ▲다르거나=근육이 강화된 동물은 자연발생적(마이오스타틴 돌연변이)으로 생기거나 크리스퍼로 만들 수도 있다. 여기서 GMO의 경계가 모호해진다. 유전자 편집은 단지 동일한 결과를 보다 신속하고 효율적으로 시행한 것이다.
사람의 질병 연구에 필요한 동물 연구 동물 모델의 필요성 특정 질병의 유전적 원인을 확인하기 위해.신약의 효능을 평가하기 위해서수술이나 세포 치료 등 의료 기술의 효율성을 검증하기 위해서.
네, 질병의 모델을 만들기. 단세포 배아에 크리스퍼를 주입해 질병의 원숭이를 만든다.원숭이로 병의 모델을 만드는 일은 마음이 편치 않지만 인간 질병의 고통을 완화하려면 사람 환자를 대신할 대상과 치료법을 탐색하는 과정이 필요하다.
배양세포가 아닌 형질전환동물에서 단백질(약품)을 생산하고 추출하는 과정은 매우 장점이 있다. 생산량이 많아 생산규모를 늘리기 쉽고 비용도 적게 든다.◆쥐나 원숭이와 같은 유전자 편집형 모델은 인간의 질병에 대한 우리의 지식을 넓히고, 유전자 편집형 돼지는 미래의 장기 기증소가 될 수 있다.
유전자 드라이브: 특정 유전자가 세대를 거듭하면서 후손에게 우선적으로 유전되도록 해 결국은 생물종 전개 개체군의 유전 형질을 바꿀 수 있다는 구상으로 질병 매개 곤충 개체군 전체를 없애거나 위험한 질병 매개 능력을 없애는 기술이 연구되고 있다.크리스퍼를 적용한 유전자 드라이브로 모기퇴치. 불임유전자 이용. 실험실 모기 멸종 성공 자연의 방사에는 신중을 기해야 한다.(이 책에서는 이해할 수 없고, 유전자 드라이브와 모기 멸종 실험 방법에 대해서는 더 조사해 보았다.) https:/m.blog.naver.com/silkcrow "'유전자 드라이브' 적용 시기상조, 제한적 연구는 계속" [2016.06.10] m.blog.naver.com.k... m.blog.naver.com
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환자를 치료하기 위해 체세포를 편집하는 것이 좋을까. 생식세포를 편집하는 것이 좋을까?체세포 편집: 자손에게 유전자 조작이 유전되지 않는다. 50조 개의 세포를 모두 수정할 수는 없다.생식세포 편집 : 유전된다. 단세포 단계에서 유전자를 교정할 수 있다. 인간 생식세포 편집은 안전과 윤리적 문제가 있다.
크리스퍼는 단성 유전자의 질병 치료에 희망적이다.(다인자 형질이나 복합적 원인의 질병에는 적합하지 않다) 모든 체세포를 편집할 필요는 없다. 유전질병 효과는 국지적으로 특정 조직에 나타나므로 가장 많이 영향을 받는 신체 부위의 세포만 치료하면 된다. (면역결핍증은 백혈구, 헌팅턴병은 뇌신경세포, 겸상적혈구병은 적혈구, 낭포성 섬유증은 폐세포) 크리스퍼를 특정 부위에 국지화하는 것이 용이하다는 뜻은 아니다.
크리스퍼를 전달하는 방법에는 생체내 in vivo 유전자 편집과 생체외 exvivo 유전자 편집 방법이 있다.1. 생체외 유전자 편집 치료법 생체외에서 하는 방법은 간단하며 실험실에서 수행되고 있다. 편집한 세포를 환자의 몸 안에 넣기 전에 철저하게 품질관리 시험을 치른다는 장점이 있다.우선 병에 걸린 세포를 몸에서 채취한다. 그래서 혈액질병 치료에 적합하다.겸양적 혈구병, 베타 지중해성 빈혈은 골수이식(타인의 건강한 조혈모세포 이식)으로 치료할 수 있다. 면역 거부 반응이 문제가 된다. 유전자 편집은 자신의 세포를 사용해 거부 반응이 없다.(과정) 환자의 골수에서 줄기세포를 분리한다. →베타글로빈 유전자 돌연변이를 크리스퍼로 교정한다. 편집한 세포를 환자에게 주입하다.혈액 이외이다